Taht yarışında Şehzade Mustafa’yı bertaraf edebilmek için Sadrazam Damat Rüstem Paşa tarafından sahte mektuplar ürettiği düşünülür. Bu mektuplar, Şehzade Mustafa’nın babası hayatta iken onun tahtına göz diktiğini ve isyan hareketlerine destekte bulunduğunu gösterir niteliktedir. Başlangıçta iddialara inanmayan Kanuni, güvendiği din alimlerinden tavsiye istedi. Güvenilen bir kölenin efendisinin parasını irtikap ettiğine ve ona karşı bir tuzak kurduğuna ilişkin hayali bir hikayeyle buna karşı ne yapılması gerektiğini sordu. Aslında bu, Mustafa’nın isyan hareketlerine başvurduğuna ve babasının tahtına göz diktiğine dair endişelerinin çok uzağındadır. O dönemin alimlerinden olan Mehmet Ebussuud Efendi Süleyman’a şu cevabı vermiştir; “bu durumda köleye ölünceye kadar işkence yapılması uygundur.” Bu ifade, şeraite göre kendisine bir cinayet izninin verilmesi demektir, ancak bir fetva niteliği taşımamaktadır. Çünkü Şehzade Mustafa'nın yaşadıkları Süleyman'ın danıştığı hikayeden çok farklıdır.
1553 yılında Veziriazam Damat Rüstem Paşa İran seferi için hareketinden sonra Aksaray taraflarına gelince, orduyu durdurdu ve yeniçerilerin Şehzade Mustafa'ya yatkınlığı olduğunu ve askerin, ihtiyarlığı sebebiyle sefere çıkamayan padişahın Dimetoka da oturmasını, Mustafa'yı hükümdar olmasını istedikleri dedikodusunun yayılmakta olduğunu bildirmek için, sipahiler ağası olan, Kızıl Ahmedliler den Şemsi Ağa'yı (Şemsi Paşa) İstanbul'a yolladı ve padişahın bizzat askerin başında sefere çıkmasını arz ederek, Aksaray'dan ileri gitmeyip bekledi.
Padişah bunu haber alınca Rüstem Paşa'yı geri çağırdı ve 1553 ağustos sonlarında kendisi İran seferine çıktı. Kütahya sancakbeyi Şehzade Bayezid'i Rumeli muhafazasında bulunmak üzere Edirne'ye gönderdi. Bolvadin'e gelince Saruhan sancakbeyi Şehzade Selim orduya gelerek el öptü. Bundan sonra padişah Aktepe konağına geldiği vakit, sefere çağrılan Şehzade Mustafa orduya iltihak ederek çadırı kuruldu. Ertesi gün şehzade babasının elini öpmek için otağ-ı hümayuna yürüdü. Çadıra girdiği zaman babasını göremedi, yedi dilsiz onu karşıladı ve hemen üstüne atılarak boğmak istedilerse de Mustafa bunların elinden kurtulup kaçarken, saray hademelerinden Zal Mahmud ağa arkadan yetişip şehzadeyi boğdu. Cesedi çadırın önüne bir İran halısı üzerinde bırakılmak suretiyle ölümü ilan edildi. Bu, aynı zamanda İran ile iş birliği yaptığı iddia edilen Şehzade Mustafa'nın durumunda bir mesaj niteliği taşıyordu. Cenazesi daha sonra Bursa’ya gönderilerek II. Murat türbesi yakınına defnedilmiştir.
Şehzade Mustafa’nın ölümü askerler ve halk arasında büyük tepki yarattı. Yeniçeriler, olaydan sorumlu gördükleri Rüstem Paşa’nın çadırına saldırdılar ancak onu bulamadılar. Matem göstergesi olarak öğlen yemeği yemediler ve Rüstem Paşa’nın azlini istediler. Kanuni artan baskı karşısında aynı gün Rüstem Paşa’yı görevden alıp yerine Kara Ahmet Paşa’yı atamak zorunda kaldı.
Şehzade Mustafa'nın katlinden sonra Konya'da olan annesi Mahidevran Sultan ve ailesi (eşleri, kızları ve oğlu Şehzade Mehmed) Bursa'ya gönderildi. Lakin Şehzade Mustafa'nın ölümünden sonra askerler arasında çıkan "Şehzade Mustafa öldüyse oğlu var, tahta o geçer!" dedikodularını işiten Kanuni torununun da boğdurulmasını emretti ve 7 yaşındaki Şehzade Mehmed babasının ölümünden bir süre sonra boğularak katledilip Şehzade Mustafa'nın yanına defnedildi. Şehzade Mustafa’nın türbesi, 1555 yılında kardeşi Şehzade Selim tarafından yaptırılmıştır.
Şehzade Mustafa’nın ölümü üzerine Fünûnî, Rahmî, Edirneli Nazmî, Muînî, Mustafa, Müdâmî, Sâmî, Kara Fazlî, Nisâyî , Şeyh Ahmed Efendi, Selîmî, Kâdirî gibi şairler mersiyeler yazdılar. Hakkında yazılmış en tanınmış mersiye, Taşlıcalı Yahya Bey tarafından yazılmış olandır. Şehzade Mustafa, sultan olmadan kendisi bu denli fazla mersiye yazılan tek şehzadedir.
“Meded meded bu cihanın yıkıldı bir yanı
Ecel celalileri aldı Mustafa Han'ı
Dolundu mihr-i cemali bozuldu erkanı
Vebale koydular al ile Al-i Osman'ı „
—Taşlıcalı Yahya Bey'in Şehzade Mustafa için yazdığı mersiyeden bir bölüm